College Note: Kinetika Fermentasi

I. Microbial

Pertumbuhan microbial biasanya ditentukan oleh waktu yang diperlukan untuk menggandakan massa sel. Waktu penggandaan massa sel dapt berbeda dengan waktu penggandaan jumlah karena massa sel dapat meningkat tanpa penambahan jumlah sel. Tetapi bila dalam suatu lingkungan tertentu interval antara penggandaan massa sel dan jumlah dengan waktu berlangsung konstan, maka mikroorganisme tumbuh pada laju eksponensial. Pada kondisi demikian pertumbuhan dapat digambarkan seperti berikut :

dX = µX (5.1)

Atau :

dN = µ_nN (5.2)

dimana : X = konsentrasi sel g/L

N = konsentrasi sel jumlah/L

T = waktu (unit)

µ = laju pertumbuhan spesifik hr^-1 (massa)

µ_n = laju pertumbuhan spesifik (jumlah)

persamaan (5.1) menggambarkan peningkatan massa sel dengan waktu dan persamaan (5.2) menggambarkan penambahyan jumlah sel dengan waktu. Sebagiann besar keadaan pertumbuhan diukur dengan peningkatan massa, jadi yang akan digunakan adalah µ. Nilai µX adalah laju pertumbuhan volumetric ( prokdutivitas volumetric) g/L-jam.

Integral persamaan (5.1) menghasilkan

dx = µ dt (5.3)

bila laju pertumbuhan spesifik konstan, persamaan (5.3) menghasilkan :

ln x₂ = µ ∆t (5.4)

x₁

persamaan (5.4) dapat diselesaikan pada kasus t=td yaitu waktu yang diperlukan untuk x₂= 2x_1,lalu :

td = ln 2 = 0,693 (5.5)

µ µ

dari persamaan (5.4) dapat dilihat bahwa laju pertumbuhan spesifik dapat diperoleh dari slop dari plot ln X versus waktu.

Kinetika pertumbuhan

Yang dimaksud dengan pertumbuhan mikrobial pada organisme adalah peningkatan jumlah sel per organisme, dimana ukuran sel menjadi lebih besar. Pada organisme uniseluler (bersel satu), pertumbuhan adalah pertambahan jumlah sel, dan pertambahan organisme, misalnya pertumbuhan yang terjadi pada suatu kultur jasad renik

Pertumbuhan disebut dalam keadaan keseimbangan jika secara teratur pada kondisi konstan, sehingga jumlah pertambahan komponen Kimia juga konstan. Sebagai contoh, pertambahan mengakibatkan penambahan massa sel sebanyak 2 kali dalam keadaan keseimbangan mengakibatkan penambahan jumlah komponen sel seperti air, protein, RNA, DNA, dan sebagainya.

Umur sel generasi ditentukan setelah proses pembelahan selesai sedangkan umur kultur ditentukan oleh lamanya inkubasi. Semakin baik nutrisi dalam substrat tempat tumbuhnya maka pertumbuhan sel semakin cepat dan ukuran sel semakin besar.

Berikut karakteristik pertumbuhan mikroorgansme :

v Bakteri menbelah diri dalam waktu 20-90 menit

v Ragi membelah diri dalam waktu 90-120 menit

v Kapang tumbuh dalam waktu 4-8 jam

Syarat-syarat tumbuhnya mikroba antara lain sebagai berikut :

Ada sel hidup

Ada sumber nutrisi

Adanya nutrisi dan faktor pertumbuhan

Tidak ada inhibitor atau toksin

Kondisi fisio-kimia yang mendukung

II. Fase- fase pertumbuhan mikroorganisme

Bila suatu sel mikroorganisme ditempatkan dalam suatu medium yang mengandung nutrisi yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroorganismedi didalam dalam suatu suatusistem sistemtertutup tertutup((batch system) maka pola pertumbuhannya mengikuti fase fase-fase tertentu

Setiap jenis mikroorganisme memiliki kekhas tersendiri

Pertumbuhan jasad renik di dalam kultur statis terdiri dari beberapa fase yang terlihat pada gambar 1.1

1. Fase Adaptasi

Jika jasad renik dipindahkan ke dalam suatu medium, mula-mula akan mengalami fase adaptasi untuk menyesuaikan dengan substrat dan lingkungan sekitarnya. Pada fase ini belum terjadi pembelahan sel Karena beberapa enzim mungkin belum disintesis. Jumlah sel pada fase ini mungkin tetap tetapi

mungkin belum disintesis. Jumlah sel pada fase ini mungkin tetap tetapi kadang-kadang menurun. Lamanya fase ini bervariasi, dapat cepat atau lambat tergantung dari kecepatan penyesuaian dengan lingkungan.

Lamanya fase adaptasi dipengaruhi oleh beberapa factor diantaranya adalah :

1. Medium dan lingkungan pertumbuhan

jika sel ditempatkan di medium yang sama dengan lingkungan sama seperti medium dan lingkungan sebelumnya maka tidak memerlukan waktu lama untuk addaptasi tetapi jika lingkungannya sangat berbeda maka akan memerlukan waktu yang cukup lama untuk adaptasi

2. Jumlah inukulum

jumlah sel awal sel yang semakin tinggi akan semakin cepat fase adaptasi. Fase-fase adaptasi mungkin berjalan lambat karena beberapa sebab, misalnya:

· Kultur yang dipindahkan dari mediun yang kaya ke medium yang kandungan nutriennya terbatas

· Mutan yang baru terbentuk menyesuaikan diri dengan lingkungannya

· Kultur yang dipindahkan dari fase statis ke medium baru dengan komposisi sama seperti medium sebelumnya

2. Fase Pertumbuhan awal

Setelah mengalami fase adaptasi, sel akan mulai membelah dengan kecepatan yang masih sangat rendah karena baru selesai tahap penyesuaian diri.

3. Fase Pertumbuahan Logaritmik

Pada fase ini sel jasad renik membelah dengan cepat dan konstan, dimana pertambahan jumlahnya mengikuti kurva logaritmik. Pada fase ini kecepatan pertumbuhan sangat dipengaruhi oleh medium tempat tumbuhnya seperti pH dan kandungan nutrient. Juga kondisi lingkungan termasuk suhu dan kelembaban udara. Pada fase ini membutuhkan energi lebih banyak dibandingkian dengan fase lainnya, selain itu sel paling sensitive terhadap lingkungan.

4. Fase Pertumbuahn Lambat

Pada fase ini pertumbuhan populasi jasad renik diperlambat karena beberapa sebab :

1) Zat nutrisi di dalam medium sudah sangat berkurang

2) Adanya hasil-hasil metabolisme yang mungkin beracun atau dapat menghambat pertumbuhan jasad renik

Pada fase ini pertumbuhan sel tidak stabil tetapi jumlah populasi masih naik karena jumlah sel yang tumbuh masih lebih banyak dari pada jumlah sel yang mati.

5. Fase Pertumbuhan Tetap (Statis)

Pada sel ini jumlah populasi sel tetap karena jumlah yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati. Ukuran sel pada fase ini menjadi lebih kecil karena sel tetap membelah meskipun zat nutrisi sudah habis. Karena kekuirangan zat nutrisi, sel kemungkinan mempunyai komposisi berbeda dengan sel yang tumbuh pada fase logaritmik. Pada fase ini sel-sel menjadi lebih tahan terhadap keadaan ekstrim seperti panas, dingin, radisasi dan bahan Kimia.

6. Fase Menuju Kematian

Pada fase ini sebagian jasad renik mulai mengalami kematian karena beberapa sebab :

1) Nutrien didalam medium sudah habis

2) Energi cadangan didalam sel habis

3) Jumlah sel semakin lama semakin semakin banyak

Kecepatan kematian disebabakan oleh kondisi nutrien, lingkungan dan jenis jasad renik

III. Faktor-faktor yang mempengaruhi jasad renik

Factor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan jasad renik yang bersuifat heterotrop antara lain :

1) Nutrien

jasad renik heterotrop membutuhkan nutrien untuk kehidupan dan pertumbuhannya yaitu sebagai berikut : Sumber karbon, Sumber nitrogen, Sumber energie dan, faktor pertumbuhan seperti vitamin dan mineral.

beberapa jasad renik seperti Eschirchia coli dan Enterobacter aerogenes, khamir dan kapang dapat tumbuh dengan baik pada media/medium yang hanya mengandung glukosa sebagai sumber nutrien organik.contoh lainnya streptokokus, stapilokokus dan dari berbagai organisme lainnya mungkin membutuhkan beberapa sumber nitrogen organik lainnya dalam bentuk asam amino, purin dan pirimidin serta faktor-faktor pertumbuhan lainnya seperti vitamin B. thiamnin ( vitamin B1), riboflvin( vitamin B2), asam nikotinat (niasin), piridoksin( vitamin B6), asam pantotenat dan kobalamin ( vitamin B12) yang oleh organisme pemilih dan sukar tumbuh

nutrien dapat masuk kedalam sel jasad renik melalui beberapa cara yaitu:

a. Transport Aktif

merupakan tranport ion, molekul, dan senyawa yang tidak memerlukan energie untuk melewati membran plasma yang mencakup osmosis dan difusi

Osmosis adalah kasus khusus dari transpor pasif, dimana molekul air berdifusi melewati membran yang bersifat selektif permeabel.

Difusi dibedakan menjadi difusi dipermudah dengan saluran protein dan difusi dipermudah dengan protein pembawa

difusi dipermudah dengan saluran protein Substansi seperti asam amino, gula, dan substansi bermuatan tidak dapat berdifusi melalui membrane plasma. Substansi-substansi tersebut melewati membran plasma melalui saluran yang di bentuk oleh protein. Protein yang membentuk saluran ini merupakan protein integral.

difusi dipermudah dengan protein pembawa proses difusi ini melibatkan protein yang membentuk suatu salauran dan mengikat substansi yang ditranspor. Protein ini disebut protein pembawa. Protein pembawa biasanya mengangkut molekul polar, misalnya asam amino dan glukosa..

b. Transport Aktif

Transpor aktif merupakan kebalikan dari transpor pasif dan bersifat tidak spontan. Arah perpindahan dari transpor ini melawan gradien konsentrasi. Transpor aktif membutuhkan bantuan dari beberapa protein. Contoh protein yang terlibat dalam transpor aktif ialah channel protein dan carrier protein, serta ionophore.

2) Tersedianya Air

Sel Jasad Renik Memerlukan air untuk hidup dan berkembang biak. selain merupakan bagian terbesar dari sel ( 70-80), air juga dibutuhkan sebagai reaktan dalam berbagai reaksi biokimia

Berikut karakteristik beberapa mikroorganisme :

a) kadar air bahan pangan kapang kurang dari 14-15 %

b) Kapang tumbuh baik pada kondisi persediaan air yang cukup

c) Khamir dapat tumbuh pada medium dengan aktivitas air relative lebih rendah yaitu 0,62-0,65 pada sirup dan sekitarv 0,78 dalam larutan garam maupun sirup.

3) Nilai Ph

pada umunya mikrooganisme dapat tumbuh pada kisaran Ph 3-6 kecuali asam laktat. Kebanyakan kapang dapat tumbuh pada kisaran pH yang luas yaitu 2-8,5 tetapi biasanya pertumbuahannya akan lebih optimum pada kondisi asam atau pH rendah. Sedangkan pada khamir Hampir sama seperti kapang akan tumbuh secara optimal pada kondisi asam ( pH 4-4,5)

4) Temperatur

mikroorganisme mempunyai suhu optimim, minimum dan maksimum untuk pertumbuhannya. Pembagian mikroorganisme berdasarkan kisaran suhu adalah :

1. Psikrofil mikrooganisme hidup antara suhu 0-35 0C tumbuh optimum pada suhu 13 0C

2. Mesofil mikrooganisme hidup antara suhu 15-55 0C tumbuh optimum pada suhu 25-40 0C

3. Termofil mikrooganisme hidup antara suhu 40-750C tumbuh optimum pada suhu 50-65 0C

Bakteri berdasarkan suhu pertumbuhannya dibagi menjadi bakteri psikrofil, mesofil, dan termofil. Kebanyakan kapang bersifat mesofilik, yaitu tumbuh baik pada suhu kamar. Suhu optimum pertumbuhan untuk kebanyakan kapang adalah sekitar 25-30 0C tetapi beberapa dapat tumbuh pada 35-37 0C atau lebih tinggi dan beberapa ada yang bersifat psikrofil, yaitu tumbuh baikpada suhu lemari es. Kisaran suhu pertumbuhan khamir hampir sama dengan kapang yaitu 25-30 0C dan maksimum 35-47 0C.

5) Tersedianya Oksigen

Berdasarkan kebutuhan akan oksigen, jasad renik dapat dibedakan atas 2 kelompok yaitu :

1. Aerob

organisme yang dapa bertahan dan berkembang dalam lingkungan yang tinggi oksigen. Terbagi menjadi :

· aerob obligat membutuhkan oksigen untuk respirasi sel .organisme ini menggunakan oksigen untuk mengoksidasi substrat(gula dan lemak) untuk memperoleh energi

· Aerobik fakultatif , dapat menggunakan oksigen tetapi juga memiliki sifat anaerobik

· Mikroaerofil, organisme yang dapat mggunakan oksigen, tetapi hanya dalam konsentrasi rendah

· Aerotolerant, organisme yang dapat hidup dalam kehadiran oksigen tetapi mereka anaerobik karena mereka tidak meggunakan oksigen sebagai terminal akseptor elektron.

2. Anaerob

adalah setia pmikroorganisme yang tidak memerlukan untuk pertumbuhan dan dapat berakibat negatif atau bahkan mungkin mati bila bereaksi dengan oksigen. Terbagi menjadi 3 kelompok :

· Anaerob obligat mikroorganisme yang tidak dapat menggunakan oksigen untuk pertumbuahan dan dapat berdampak negati untuk organisme tersebut

· aerotolerant mikroorganisme yang tidak menggunakan oksigen untuk pertumbuhan tetapi dapat mentolerir keberadaan oksigen

· anaerobik fakultatif, mikroorganisme yang dapat tumbuh tanpa oksigen dan dapat memanfaatkan oksigen bila ada.

Aerob Obligat anaerob obligat

Fakultatif aerob dan anaerob mikroaerofil

6) Komponen Anti Mikroba

Adanya komponen antimikroba dalah melalui beberapa cara yaitu:

· Terdapat secara alamiah

· Ditambahkan secara sengaja

· Terbentuk selama pengolahan

IV. Media Pertumbuhan

Media pertumbuhan adalah cairan atau gel yang dirancang untuk mendukung pertumbuhan mikroorganisme atau sel atau tanaman kecil seperti lumut. Ada 2 jenis media pertumbuhan utama yaitu : media yang digunakan untuk kultur sel dengan menggunakan sel khusus yang berasal dari sel hewan atau tanaman dan media yang digunakan untuk pertumbuhan mikroorganisme seperti bakteri dan ragi secara umun menggunakan media agar. Perbedaan antara media yang digunakan untuk kultur sel dengan media untuk pertumbuhan mikroorganisme adalah Pada kultur sel, sel tidak akan tumbuh tanpa adanya penambahan hormon atau faktor pertumbuhan lainnya sedangkan pada media organisme hal itu tidak berlaku. Selain itu Kultur sel memerlukan media cair sedangkan mikroorganisme dapat tumbuh pada media cair atau padat. Dalam hal ini yang akan kita bahas adalah media pertumbuhan untuk mikroorganisme . Pemilihan media yang baik sama pentingnya dengan prmilihan mikroorganisme yang dapat melakukan fermentasi untuk menghasilkan produk yang diingkinkan. Media merupakan sumber nutrisi bagi pertumbuhan, energi, pembentukan sel dan biosintesa bagi hasil fermentasi, dimana yang paling penting adalah adanya sumber karbon dan nitrogen yang paling penting yang harus terdapat dalam media karena sel mikroogranisme dan hasil produknya tersusun dari zat-zat tersebut

Media sederhana terbagi menjadi 2 yaitu :

1. media sintesis ( media terdefenisi)

Merupakan media yang terpilih sebagai suatau media yang dikehendaki karena tersusun dari komponen-komponen yang telah diketahui persenyawaannya dan telah ditentukan. Masing-masing komponennya adalah persenyawaan yang murni, dan jumlahnya ditambahkan kedalam media diketahui pula

2. Media non sintesis (undefined media)

merupakan media yang tidak diketahui komposisi dari komponen-komponen persenyawaannya. Media ini dipilih dikarenakan kebutuhan organisme yang tidak pernah dikembangbiakkan pada media yang ditetapkan.

Selain jenis diatas terdapat beberapa jenis media fermentasi antara lain :

1. Media gizi

ini adalah media yang tidak terdefenisi karena sumber asam amino mengandung persenyawaan dengan komposisi yang tidak diketahui. Media gizi mengandung semua media gizi mengandung semua unsur yang paling perlu bakteri untuk pertumbuhan dan non-selektif, sehingga mereka digunakan untuk budidaya umum dan pemeliharaan bakteri disimpan dalam koleksi kultur laboratorium.

Jenis-jenis media gizi :

· Media terdefinisi (juga dikenal sebagai medium basal atau kompleks) adalah media yang berisi:

· sumber karbon seperti glukosa untuk pertumbuhan bakteri

· air

· berbagai garam yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri

· Media ditetapkan (juga dikenal sebagai media didefinisikan secara kimia atau media sintetik)

· semua bahan kimia yang digunakan dikenal

· tidak mengandung ragi, hewan atau tumbuhan jaringan

· Diferensial menengah

· semacam indikator, biasanya pewarna, adalah ditambahkan, yang memungkinkan untuk diferensiasi reaksi kimia tertentu yang terjadi selama pertumbuhan.

gambar media gizi

2. Media Minimal

media Minimal adalah yang mengandung nutrisi minimum mungkin untuk pertumbuhan koloni, umumnya tanpa kehadiran asam amino, dan sering digunakan oleh ahli mikrobiologi dan genetika untuk tumbuh "wild type" mikroorganisme. Minimal media juga dapat digunakan untuk memilih terhadap rekombinan atau exconjugant. Minimal menengah biasanya berisi:

· sumber karbon untuk pertumbuhan bakteri, yang mungkin menjadi gula seperti glukosa , atau sumber energi yang kaya kurang seperti suksinat

· berbagai garam, yang mungkin berbeda antara bakteri spesies dan kondisi pertumbuhan; ini umumnya menyediakan unsur-unsur penting seperti magnesium, nitrogen, fosfor, dan belerang untuk memungkinkan bakteri untuk mensintesis protein dan asam nukleat

· air

3. Media Selektif

Selektif media yang digunakan hanya untuk pertumbuhan mikroorganisme yang dipilih. Sebagai contoh, jika suatu mikroorganisme resisten terhadap suatu antibiotik tertentu , seperti ampisilin atau tetrasiklin , maka antibiotik dapat ditambahkan ke media dalam rangka untuk mencegah sel lain, yang tidak memiliki resistensi, untuk tumbuh.

Beberapa contoh media selektif meliputi :

· agar biru metilen (EMB) yang berisi biru metilen - beracun untuk bakteri Gram-positif , hanya memungkinkan pertumbuhan bakteri Gram negatif

· YM ( ragi dan jamur ) yang memiliki rendah pH , menghambat pertumbuhan bakteri

· agar darah (digunakan untuk strep tes), yang berisi darah jantung sapi yang menjadi transparan di hadapan hemolytic Streptococcus

· Agar MacConkey untuk Gram-negatif bakteri

· Agar Hektoen enterik (HE) yang selektif untuk bakteri Gram-negatif

· Agar garam manitol (MSA) yang selektif untuk bakteri Gram-positif dan diferensial untuk manitol

· Terrific Broth (TB) digunakan dengan gliserol dalam budidaya strain Escherichia coli rekombinan

· lisin xilosa desoxyscholate (XLD), yang selektif untuk bakteri Gram-negatif

· agar-agar buffer ekstrak ragi arang, yang selektif untuk bakteri gram-negatif tertentu, terutama legionella pneumophila

contoh media selektif :

EMB ( eosin metylen blue)

4. Media differensial

Diferensial media atau media indikator untuk membedakan satu jenis mikroba yang diambil dari pertumbuhhan yang lain di media yang sama. jenis media ini menggunakan karakteristik biokimia dari suatu mikroorganisme yang tumbuh di hadapan nutrisi tertentu atau indikator (seperti netral merah , merah fenol , eosin y , atau metilen biru ) ditambahkan ke medium untuk menunjukkan ciri-ciri tertentu dari suatu mikroorganisme. Jenis media ini digunakan untuk mendeteksi mikroorganisme dan oleh para ahli biologi molekuler untuk mendeteksi rekombinan strain bakteri. Contoh media differensial meliputi :

· eosin metilen biru (EMB), yang berbeda untuk fermentasi laktosa dan sukrosa

· (MCK), yang berbeda untuk fermentasi laktosa

· garam manitol agar (MSA), yang berbeda untuk fermentasi manitol

· X-gal piring, yang diferensial untuk operon lac mutan

Contoh media differensial :

Alpha Hemolytic Streptococci

RBC dengan lysis tidak lengkap

Beta Hemolytic Streptococci

RBC dengan lysis lengkap

Gamma Hemolytic Streptococci

RBC tanpa lysis

V. Teknik pembudidayaan khusus

1. Bakteri anaerob

· media pengurangan(Reducing Media)

media pengurangan berisi reduktor yang menguras oksigen. hal ini diperlukan untuk menumbuhkan bakteri anaerob obligat, karena mereka tidak dapat tumbuh dengan adanya oksigen

· Kontainer Anaerobik

Sebuah wadah untuk pertumbuhan mikroorganisme anaerob memiliki penampang berbentuk kerucut dan penutup yang cocok dengan penampang berbentuk kerucut yang menentukan volume yang antara kedua bagian . Suatu aliran melimpah menggalir melalui sekitar piring, dan pinggiran piring dan menutup segel bersama-sama dengan medium agar membawa kelebihan organisme diperas dari volume sebagai penutup yang diletakkan ke piring. Koloni organisme dapat dilihat baik melalui makanan atau menutup karena masing-masing adalah transparan

· Agar shake( agar goyang)

Sebuah metode untuk mengisolasi bakteri anaerob dengan menggoyangkan media cair dalam sebuah agar-agar atau gelatin untuk mendistribusikan inokulum sebelum media memadat.

Gambar agar shake

· Agar stab

Sebuah media untuk bakteri anaerobik yang dibuat dengan cara menusuk medium agar padat dalam tabung tes dengan jarum untuk mengisolasikan kultur tertutup dengan inokulum bakteri.

gambar agar stab

2.Bakteri Microaerophilic

· tumbuh terbaik di bawah pengurangan tingkat O₂ dan peningkatkan kadar CO2

· Atmosfer normal 21 % kadar O₂

3 to .03 %kadar CO₂

1. candle jar

suatu metoda yang digunakan untuk anaerobiosis, sebuah lilin menyala ditempatkan sebagai tabung kedap udara . bertujuan untuk menghilangkan oksigen.

2. CO₂ generating packet

Merupakan suatu metode yang digunakan untuk membangkitkan CO₂ dengan cara meletakkan cawan petri kedalam kantong kedap udara dan meletakkan gae generator untuk menghasilkan CO₂ .